乳酸脫氫酶（Lactate Dehydrogenase，LDH）試劑盒說明書

分光光度法 50 管/24 樣

測定意義：

LDH（EC 1.1.1.27）廣泛存在于動物、植物、微生物和培養(yǎng)細胞中，是糖酵解途徑的末端酶，催化丙酮酸與乳酸之間的可逆反應(yīng)，伴隨著 NAD+/NADH 之間互變。

測定原理：

LDH 催化 NAD+氧化乳酸生成丙酮酸，丙酮酸進一步與 2, 4 - 二硝基苯肼作用生成丙酮酸二硝基苯腙，在堿性溶液中顯棕紅色，顏色深淺與丙酮酸濃度成正比。

需自備的儀器和用品：

可見分光光度計、恒溫水浴鍋、臺式離心機、可調(diào)式移液器、1 mL 玻璃比色皿、研缽、冰和蒸餾水。

試劑的組成和配制：

提取液：30mL×1 瓶， 4℃保存；試劑一：液體 15 mL×1 瓶， 4℃保存；

試劑二：粉劑×1 支，-20℃保存，用時加入 1.3 mL 蒸餾水充分溶解備用，配好后-20 ℃保存，可保存兩周，禁止反復凍融；試劑三：液體 15 mL×1 瓶，4℃保存；

試劑四：液體 50 mL×1 瓶，4℃保存；

樣品測定的準備：

1、細菌、細胞或組織樣品的制備：

細菌或培養(yǎng)細胞：先收集細菌或細胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照細菌或細胞數(shù)量（10⁴ 個）：提取液體積（mL）為 500~1000：1 的比例（建議 500 萬細菌或細胞加入 1mL 提取液），超聲波破碎細菌或細胞（冰浴，功率 20％或 200W，超聲 3s，間隔 10s，重復 30 次）； 8000g 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測。

組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為 1：5~10 的比例（建議稱取約 0.1g 組織，加入 1mL 提取液），進行冰浴勻漿。8000g 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測。2、血清（漿）樣品：直接檢測。

測定步驟：

1、分光光度計預熱 30min 以上，調(diào)節(jié)波長至 450nm，蒸餾水調(diào)零。

2、樣本測定（在 EP 管中加入下列試劑）

充分混勻，37℃（哺乳動物）或 25℃（其它物種）水浴 15min

試劑四                      750                         750

充分混勻，室溫靜置 3 分鐘，450 nm 下測定吸光度，計算ΔA=A 測定管-A 對照管。每個測定管需要設(shè)一個對照管。

LDH 活力單位的計算：

1、標準條件下測定的回歸曲線， y = 0.725x (x 為標準品濃度，umol/mL；y 為對吸光度)。2、血清（漿）LDH 活力的計算單位的定義：每 mL 血清（漿）每分鐘催化產(chǎn)生 1nmol 丙酮酸定義為一個酶活力單位。

LDH（U/mL）=ΔA÷0.725÷T×10³=92×ΔA

3、細胞、細菌和組織中 LDH 活力的計算（1）按樣本蛋白濃度計算：

單位的定義：每 mg 組織蛋白每分鐘催化產(chǎn)生 1 nmol 丙酮酸定義為一個酶活力單位。

LDH（U/mg prot）=[ΔA÷0.725×V1]÷(V1×Cpr)÷T×10³ =92×ΔA÷Cpr

需要另外測定，建議使用本公司 BCA 蛋白質(zhì)含量測定試劑盒。（2） 按樣本鮮重計算：

單位的定義：每 g 組織每分鐘催化產(chǎn)生 1nmol 丙酮酸定義為一個酶活力單位。

LDH（U/g 鮮重）=[ΔA÷0.725×V1]÷(W×V1÷V2)÷T×10³ =92×ΔA÷W

（3）按細菌或細胞密度計算：

單位的定義：每 1 萬個細菌或細胞每分鐘催化產(chǎn)生 1nmol 丙酮酸定義為一個酶活力單位。

LDH（U/10⁴ cell）= [ΔA÷0.725×V1]÷(500×V1÷V2)÷T×10³ =0.184×ΔA÷W

V1：加入反應(yīng)體系中樣本體積，0.05mL；V2：加入提取液體積，1 mL；T：反應(yīng)時間，15 min；Cpr：蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；500：細胞或細菌總數(shù)，500 萬。