分光光度法 50 管/24 樣

注意：正式測(cè)定之前選擇 2-3 個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測(cè)定。

測(cè)定意義

磷脂酶 A2（EC3.1.1.4）是磷脂 sn-2 位脂?；饷?，廣泛存在于動(dòng)植物組織、細(xì)菌、細(xì)胞核分泌物中，參與脂肪消化，精子成熟、細(xì)胞信號(hào)傳遞、脂質(zhì)過氧化修復(fù)、宿主反應(yīng)等生理過程，在控制體內(nèi)磷脂類物質(zhì)平衡、調(diào)節(jié)機(jī)體新陳代謝、參與疾病的病理進(jìn)程等方面發(fā)揮著及其重要的作用。

測(cè)定原理

磷脂酶 A2 作用于 2-硫代十六酰乙基磷酸膽堿（HEPC）產(chǎn)生游離巰基，與DTNB 反應(yīng)生成黃色物質(zhì)，在 412nm 處有特征吸收峰。

自備實(shí)驗(yàn)用品及儀器

天平、超速冷凍離心機(jī)、研缽、可見分光光度計(jì)、1 mL 玻璃比色皿。

試劑組成和配制

提取液：液體 50mL×1 瓶，4℃保存。

試劑一：液體 50mL×1 瓶，4℃保存。試劑二：液體 50mL×1 瓶，4℃保存。

試劑三：液體×5 瓶，-20℃避光保存。臨用前根據(jù)用量每瓶加入 4.5mL 試劑二充分混勻；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融。

樣品處理

1. 組織：按照質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為 1：5~10 的比例（建議稱取約 0.1g，加入 1mL提取液）加入提取液，冰浴勻漿后于 4℃，10000g 離心 5min，取全部上清于 4℃、100000g離心 30min，棄上清，取沉淀溶于 1mL 試劑一。

2. 細(xì)胞：按照細(xì)胞數(shù)量（10⁴ 個(gè)）：提取液體積（mL）為 500~1000：1  的比例（建議 500萬細(xì)胞加入 1mL 提取液），冰浴超聲波破碎細(xì)胞（功率 300w，超聲 3 秒，間隔 7 秒，總時(shí)間 3min）；然后于 4℃，10000g 離心 5min，取全部上清于 4℃、100000g 離心 30min，棄上清，取沉淀溶于 1mL 試劑一。

3. 血清：直接測(cè)定。

 測(cè)定操作 

磷脂酶 A2（phospholipase A2，PLA2）試劑盒計(jì)算公式

1. 按照蛋白濃度計(jì)算

酶活性定義：每毫克蛋白每分鐘水解 HEPC 產(chǎn)生 1nmol 游離巰基所需的酶量為一個(gè)酶活力單位。

PLA2 活性（nmol/min/mg prot）= △ A÷（ ×d）×V 反總÷（V 樣×Cpr）÷T

= 73.53×△ A÷Cpr

2. 按照樣本質(zhì)量計(jì)算

酶活性定義：每克組織每分鐘水解 HEPC 產(chǎn)生 1nmol 游離巰基所需的酶量為一個(gè)酶活力單位。

PLA2 活性（nmol/min/g 鮮重）= △ A÷（ ×d）×V 反總÷（W×V 樣÷V 樣總）÷T= 73.53×△ A÷W

3. 細(xì)胞數(shù)量計(jì)算

酶活性定義：每 10⁴ 個(gè)細(xì)胞每分鐘水解 HEPC 產(chǎn)生 1nmol 游離巰基所需的酶量為一個(gè)酶活力單位。

PLA2 活性（nmol/min/10⁴ cell）= △ A÷（ ×d）×V 反總÷（V 樣×細(xì)胞數(shù)量÷V 樣總）÷T= 73.53×△ A÷細(xì)胞數(shù)量

4 按照液體體積計(jì)算

酶活性定義：每毫升血清每分鐘水解 HEPC 產(chǎn)生 1nmol 游離巰基所需的酶量為一個(gè)酶活力單位。

PLA2 活性（nmol/min/mL）= △ A÷（ ×d）×V 反總÷V 樣÷T

= 73.53×△ A

：TNB 消光系數(shù)，13600L/mol/cm；d：比色皿光徑，1cm；V 反總：反應(yīng)總體積，1mL； V 樣：反應(yīng)體系中加入樣本體積，0.1mL；W：樣本質(zhì)量，g；V 樣總：加入提取液體積，1mL； T：反應(yīng)時(shí)間，10min