產(chǎn)品簡介：

線粒體是細(xì)胞呼吸的主要場所，細(xì)胞活動所需的能量主要由在線粒體內(nèi)進行的氧化所產(chǎn)生的能量來供應(yīng)。制備線粒體的關(guān)鍵是保持線粒體的完整性和純度，可通過分級分離法獲得， 即先低速離心除去細(xì)胞核以及細(xì)胞碎片，再進行高速梯度離心分離線粒體。

 細(xì)胞線粒體分離試劑盒(Cell Mitochondria Isolation Kit)是快速便捷分離培養(yǎng)細(xì)胞中的線粒體的試劑盒，分離線粒體的同時可以獲得去除線粒體的細(xì)胞漿蛋白，可用于分析細(xì)胞色素C 等線粒體蛋白向胞漿的釋放，大部分獲得的線粒體都含有完整的內(nèi)膜和外膜，并具有線粒體的生理功能(如檢測線粒體膜電位)，獲得的蛋白可用于 SDS-PAGE、Western、雙向電泳等蛋白分析。該試劑盒僅用于科研領(lǐng)域，不宜用于臨床診斷或其他用途。

自備材料：

1、 胰蛋白酶

2、 低溫離心機、勻漿器

3、 PBS

操作步驟(僅供參考)：

1、清洗：用預(yù)冷的 PBS 清洗細(xì)胞 1 次，4℃ 1000g 離心 5min，棄上清。

2、裂解：沉淀用1～2ml 預(yù)冷的Mitochondria Lysis buffer 重懸細(xì)胞，冰浴放置10～15min， 可用相差顯微鏡檢測膨脹的程度。

3、勻漿：把細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至 Dounce 勻漿器中，勻漿 10～20 次。不同細(xì)胞或不同勻漿器所需的勻漿次數(shù)有所不同，需自行優(yōu)化。

4、取勻漿液，立即加入等量 Wash buffer，輕輕顛倒混勻數(shù)次。

5、4℃ 1300g 離心 5min 以去除細(xì)胞核、未破碎的細(xì)胞和大的膜碎片。

6、上清液轉(zhuǎn)移至一干凈離心管，4℃ 1000g 離心 5min，重復(fù) 2 次。

7、上清液轉(zhuǎn)移至一干凈離心管，4℃ 12000～15000g 離心 15min，重復(fù) 1 次。

8、棄上清，沉淀為線粒體。如果希望獲得去除線粒體的細(xì)胞漿蛋白，應(yīng)在本步驟中收集上清，并且在收集上清時注意勿觸及沉淀，隨后把收集的上清 12000g 4℃離心 10min，上清即為去除線粒體的細(xì)胞漿蛋白。

9、保存：棄上清，用適當(dāng)緩沖液懸浮沉淀。如果用于線粒體酶活性或功能的分析，線粒體沉淀應(yīng)重懸于 Mitochondria Stock buffer；如果用于細(xì)胞漿蛋白的分析，獲得的細(xì)胞漿蛋白應(yīng)保存于 1×Protein Stock buffer，即按細(xì)胞漿蛋白：Protein Stock buffer (5×)=4：1 比例混合；如果用于雙向電泳，應(yīng)使用恰當(dāng)?shù)谋４嬉骸?/span>

 注意事項：

1、細(xì)胞計數(shù)   (如臺盼藍(lán)染色液)對于不同實驗不必全部使用，實驗條件成熟后可以不用。

2、如果不是用于制備線粒體蛋白，Mitochondria Lysis buffer 和Wash buffer 中不必加

入 PMSF。如果用于制備線粒體蛋白樣品，Mitochondria Lysis buffer 和 Wash buffer 中需添加 PMSF。PMSF 一定要在試劑加入到樣品中前 1～2min 內(nèi)加入，以免 PMSF 在水溶液中失效

3、分離線粒體的所有步驟均需在冰上或 4℃進行，所用溶液需冰浴或 4℃預(yù)冷，全部操作時間盡量控制在 1h 以內(nèi)。

4、通常在分離線粒體時前后兩次離心速度選取 1000g 和 15000g，如果希望純度更高，但對線粒體的得率要求不高，前后兩次離心速度可用 2000g 和 6000g。

5、為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。