僅供科研使用，不可用于臨床診斷和治療

凍存細(xì)胞接收后的處理：

1）干冰運(yùn)輸，收到細(xì)胞后推薦直接復(fù)蘇1管，另一管放入-80度冰箱保存過(guò)夜后轉(zhuǎn)入液氮，細(xì)胞直接轉(zhuǎn)入液氮暫存可能導(dǎo)致細(xì)胞復(fù)蘇率降低。

2）收到細(xì)胞后，若發(fā)現(xiàn)干冰已經(jīng)*揮發(fā)、凍存管瓶蓋破裂脫落,請(qǐng)立即拍照后與我們聯(lián)系。

復(fù)蘇細(xì)胞接收后的處理：

1）收到細(xì)胞后，請(qǐng)首先檢查培養(yǎng)瓶是否破損或漏液，培養(yǎng)液是否混濁，如有漏液及培養(yǎng)液混濁情況請(qǐng)立即拍照把圖片發(fā)給我們。

2）在顯微鏡下確認(rèn)細(xì)胞狀態(tài)并拍照100倍和200倍的照片2~3組以及培養(yǎng)瓶外觀照留存。

3）75%酒精消毒瓶身后放培養(yǎng)箱中靜置4-6h后，在顯微鏡下確認(rèn)細(xì)胞狀態(tài)并拍照100倍和200倍的照片，若有貼壁細(xì)胞脫落，可收集上清離心，1000rpm離心5min，離心后棄去上清，用新鮮*培養(yǎng)基重懸后加入T25培養(yǎng)瓶或60mm皿中，補(bǔ)加適量培養(yǎng)基，T25培養(yǎng)瓶加6-8ml培養(yǎng)基。

3）建議收到當(dāng)天不要消化處理，如果細(xì)胞長(zhǎng)滿90%，可選擇傳代處理。

4）如您收到細(xì)胞7天內(nèi)沒有反饋相關(guān)問(wèn)題，出現(xiàn)的細(xì)胞問(wèn)題將不提供免費(fèi)重發(fā)服務(wù)。

注：發(fā)貨用培養(yǎng)基不可再次用來(lái)培養(yǎng)細(xì)胞

細(xì)胞培養(yǎng)方法：

1、細(xì)胞傳代：細(xì)胞密度達(dá)到80-90%時(shí)即可傳代

①棄去培養(yǎng)上清，用PBS或生理鹽水清洗1-2次；

②加入 1~2ml0.25%胰酶（T25瓶），使胰酶覆蓋整個(gè)瓶或皿底細(xì)胞，蓋好放入培養(yǎng)箱消化；

③細(xì)胞消化0.5-2min（具體時(shí)間根據(jù)鏡下形態(tài)判斷，難消化細(xì)胞可適當(dāng)延長(zhǎng)消化時(shí)間），顯微鏡下觀察細(xì)胞，細(xì)胞回縮，即將脫壁而未脫壁時(shí)（可用槍輕輕吹打確認(rèn)細(xì)胞是否脫壁），加入新鮮的*培養(yǎng)基終止消化（若消化過(guò)度可能會(huì)對(duì)細(xì)胞存活率產(chǎn)生較大影響）；

④將細(xì)胞懸液1000RPM左右條件下離心4min，棄上清；

⑤加1-2ml新鮮*培養(yǎng)基吹勻重懸后按照1:2比例加入2個(gè)T25培養(yǎng)瓶或60mm皿中，補(bǔ)加適量培養(yǎng)基，T25培養(yǎng)瓶加6-8ml培養(yǎng)基；

⑥懸浮細(xì)胞直接離心收集，細(xì)胞沉淀重懸后分到新培養(yǎng)瓶中。

注：第一次傳代推薦1:2傳代，后續(xù)可根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)以及客戶需求自行確定。

2、細(xì)胞復(fù)蘇：

①將凍存管在37℃溫水中快速搖晃融化，時(shí)間1min左右，加入4-5ml培養(yǎng)基混勻；

②在1000RPM左右條件下離心4min，棄上清,加1-2ml新鮮*培養(yǎng)基吹勻，將細(xì)胞懸液加入T25培養(yǎng)瓶或者60mm培養(yǎng)皿

中，補(bǔ)加適量培養(yǎng)基，T25培養(yǎng)瓶加6-8ml培養(yǎng)基。

3、細(xì)胞凍存：待細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好時(shí)進(jìn)行細(xì)胞凍存

①棄去培養(yǎng)上清，用PBS或生理鹽水清洗1-2次，加入2 ml0.25%胰酶（T25瓶），使胰酶覆蓋整個(gè)瓶或皿底細(xì)胞，蓋好放入培養(yǎng)箱消化；

②細(xì)胞消化0.5-2min（具體時(shí)間根據(jù)鏡下形態(tài)判斷），顯微鏡下觀察細(xì)胞，細(xì)胞回縮，即將脫壁而未脫壁時(shí)（可用槍輕輕吹打確認(rèn)細(xì)胞是否脫壁），加入培養(yǎng)基終止消化（若消化過(guò)度可能會(huì)對(duì)細(xì)胞存活率產(chǎn)生較大影響）；

③將細(xì)胞懸液1000RPM左右條件下離心4min，棄上清，加入配制好的凍存培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，凍存液的添加量按細(xì)胞最終濃度為1~10×10⁶/ml添加；

④將凍存管放入程序降溫盒，放入-80℃冰箱，4小時(shí)后將凍存管轉(zhuǎn)入液氮罐儲(chǔ)存。