1 原理及用途

本試劑盒采用間接競爭ELISA方法檢測蜂蜜、動物組織（雞肉、豬肉、魚、蝦）、牛奶、奶粉和雞蛋等樣本中的恩諾沙星（Enrofloxacin，ENR），試劑盒由預(yù)包被偶聯(lián)抗原的酶標(biāo)板、辣根酶標(biāo)記物、抗體、標(biāo)準(zhǔn)品及其他配套試劑組成。檢測時，加入標(biāo)準(zhǔn)品或樣品溶液，樣本中的恩諾沙星和酶標(biāo)板上預(yù)包被偶聯(lián)抗原競爭抗恩諾沙星抗體，加入酶標(biāo)記物后，用TMB底物顯色，樣本吸光度值與其所含恩諾沙星含量成負相關(guān)，與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較即可得出樣本中恩諾沙星的殘留量。

2 技術(shù)指標(biāo)

2.1 試劑盒靈敏度：0.2ppb(ng/ml)

2.2 反應(yīng)模式：25℃，45min～15min

2.3 檢測下限：

組織（雞肉、豬肉、魚、蝦） ………0.6ppb

蜂蜜 ……………………………………0.8ppb

牛奶 ……………………………………6ppb

奶粉 ……………………………………10ppb

雞蛋 ……………………………………6ppb

尿樣 ……………………………………1ppb

血清 ……………………………………6ppb

2.4 交叉反應(yīng)率：

恩諾沙星………………………………100%

噁喹酸…………………………………28%

左氧氟沙星……………………………10%

洛美沙星………………………………4%

麻保沙星………………………………4%

沙拉沙星………………………………2%

 2.5 樣本回收率：

組織、蜂蜜、牛奶、奶粉、雞蛋、血清……85%±15%

3 試劑盒組成

酶標(biāo)板……………………………96孔

標(biāo)準(zhǔn)液：各1ml

0ppb、0.2ppb、0.6ppb、1.8ppb、5.4ppb、16.2ppb

高標(biāo)準(zhǔn)液（紅蓋）：100ppb …………1ml

酶標(biāo)記物（紅蓋）……………………5.5ml

抗體工作液（藍蓋）…………………5.5ml

底物液A（白蓋）……………………6ml

底物液B（黑蓋）……………………6ml

終止液（黃蓋）………………………6ml

20×濃縮洗滌液（白蓋）……………40ml

5×復(fù)溶液（黃蓋）…………………50ml

說明書 ………………………………1份

蓋板膜…………………………………1張

自封袋…………………………………1個

4 需要的器材和試劑

4.1 儀器：酶標(biāo)儀、打印機、均質(zhì)器 、氮氣吹干裝置、振蕩器、離心機、刻度移液管、天平（感量0.01g）

4.2 微量移液器：單道20µl-200µl，100µl-1000µl、多道300µl

4.3 試劑：無水乙腈、正己烷、濃HCl

5 樣本前處理

5.1 樣本處理前須知：

實驗器具必須潔凈并使用一次性吸頭，以避免污染干擾實驗結(jié)果。

5.2 配液：

配液1：0.15M鹽酸溶液

    取5ml濃鹽酸，加入去離子水混勻，定容至400ml。

配液2：樣本提取液

    量取10ml 0.15M鹽酸溶液（配液1）加入到90ml無水乙腈中混合均勻。

配液3：1×復(fù)溶液

將5×復(fù)溶液用去離子水5倍稀釋（1份復(fù)溶液加4份去離子水），用于樣本的復(fù)溶，復(fù)溶液在4℃環(huán)境可保存一個月。

配液4:工作洗滌液

    將濃縮洗滌液20倍稀釋(1份洗滌液加19份去離子水)。

5.3 樣本前處理步驟：

5.3.1 動物組織（雞肉、豬肉、魚、蝦）處理方法

1）稱2.0±0.05g 均質(zhì)過的組織樣本于50ml離心管中；

2）加入8ml樣本提取液（配液2），振蕩5分鐘，室溫4000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘；

3）取2ml清澈上層有機相至潔凈干燥的10ml玻璃試管中，50-60℃水浴氮氣吹干；

4）加入1ml正己烷，振蕩2分鐘，再加1ml復(fù)溶液（配液3），振蕩30秒，室溫4000轉(zhuǎn)/分離心5分鐘；

5）去除上層正己烷，取下層水相50µl液體用于分析。

樣本稀釋倍數(shù)：2    檢測下限：0.6ppb

5.3.2 蜂蜜處理方法

1）取1.0±0.05g蜂蜜至50ml聚苯乙烯離心管中，加6ml樣本提取液（配液2），振蕩5分鐘，使其充分溶解；

2）加入3ml復(fù)溶液（配液3），加入11ml二氯甲烷，振蕩5分鐘，室溫4000轉(zhuǎn)/分，離心5分鐘；

3）吸去上層，取下層有機相8ml至干燥容器中，50-60℃水浴氮氣吹干；

4）用1ml復(fù)溶工作液溶解干燥的殘留物，再加入正己烷1ml混合30秒，室溫3000轉(zhuǎn)/分以上，離心5分鐘；

5）去除上層取下層50µl液體用于分析。

樣本稀釋倍數(shù)：2    檢測下限：0.8ppb

5.3.3 牛奶處理方法：

1）取25µl樣本液與475µl復(fù)溶液（配液3）混合，振蕩1分鐘，使其充分溶解；

2）取50µl液體用于分析。

樣本稀釋倍數(shù)：20    檢測下限：6ppb

5.3.4 奶粉處理方法：

1）稱取0.5±0.02g均質(zhì)物至10ml聚苯乙烯離心管中，加入

5ml去離子水，振蕩，使其充分溶解；

2）取100µl樣本液與400µl復(fù)溶液（配液3）混合，振蕩1分鐘；

3）取50µl液體用于分析。

樣本稀釋倍數(shù)：50    檢測下限：10ppb

5.3.5 雞蛋處理方法：

1）稱取1.0±0.02g均質(zhì)物至10ml聚苯乙烯離心管中，加入5ml去離子水，振蕩，使其充分溶解；

2）取100µl樣本液與400µl復(fù)溶液（配液3）混合，振蕩1分鐘；

3）取50µl液體用于分析。

樣本稀釋倍數(shù)：30    檢測下限：6ppb

5.3.6 尿樣本處理方法

1）用4ml 1×復(fù)溶液與1ml經(jīng)離心后的清亮尿樣本混合，混合30s；

2）取50µl液體用于分析。  

樣本稀釋倍數(shù): 5    檢測下限：1ppb

5.3.7 血清處理方法

1）取50µl血清樣本與1450µl復(fù)溶液（配液3）混合，振蕩1分鐘；

2）取50µl液體用于分析。

樣本稀釋倍數(shù): 30    檢測下限：3ppb 

6 酶聯(lián)免疫試驗步驟

    將所需試劑從4℃冷藏環(huán)境中取出，置于室溫平衡30min以上, 洗滌液冷藏時可能會有結(jié)晶需恢復(fù)到室溫以充分溶解，每種液體試劑使用前均須搖勻。取出需要數(shù)量的微孔板及框架，將不用的微孔板放入自封袋，保存于2-8℃。

6.1 編    號：將樣本和標(biāo)準(zhǔn)品對應(yīng)微孔按序編號，每個樣本和標(biāo)準(zhǔn)品做2孔平行，并記錄標(biāo)準(zhǔn)孔和樣本孔所在的位置。

6.2 加樣反應(yīng)：加標(biāo)準(zhǔn)品或樣本50µl/孔到各自的微孔中，然后加酶標(biāo)記物50µl/孔，再加入50µl/孔的抗體工作液，用蓋板膜封板，輕輕振蕩5秒混勻，25℃反應(yīng)45分鐘。

6.3 洗    滌：小心揭開蓋板膜，甩去孔內(nèi)液體，每孔加350ul工作洗滌液，靜置30秒后棄去，重復(fù)洗滌5次，最后一次拍干（用吸水紙拍干，拍干后未被清除的氣泡可用干凈的槍頭刺破）。

6.4 顯    色：每孔加入底物液A 50µl，再加底物液B 50µl，輕輕振蕩5秒混勻，25℃避光顯色15分鐘（若藍色過淺，可適當(dāng)延長反應(yīng)時間）。

6.5 終    止：每孔加入終止液50µl，輕輕振蕩混勻，終止反應(yīng)。

6.6 測吸光值：用酶標(biāo)儀于450nm處測定每孔吸光度值（建議用雙波長450/630nm）。測定應(yīng)在終止反應(yīng)后10分鐘內(nèi)完成。