技術(shù)文章
Technical articles注意:正式測定之前選擇 2-3 個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測定。 測定意義:
哺乳動(dòng)物CarE,也稱脂族酯酶(aliesterase),廣泛分布于組織和器官,屬于絲氨酸水解酶家
族。CarE 催化含酯鍵、酰胺鍵和硫酯鍵的內(nèi)源性與外源性物質(zhì)水解,但不能催化水解乙酰
膽堿及其類似物。CarE 參與脂質(zhì)運(yùn)輸和代謝,并且與多種藥物、環(huán)境毒物以及致癌物的解
毒和代謝有關(guān),有機(jī)磷農(nóng)藥可結(jié)合并且抑制CarE 活性。
測定原理:
CarE 能催化乙酸-1-萘酯生成萘酯,固籃顯色;在450 nm 光吸收增加速率,計(jì)算CarE 活性。
自備儀器和用品:
可見分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、微量玻璃比色皿/96 孔板、低溫離心機(jī)、水浴鍋、可調(diào)式移液槍和
蒸餾水。
試劑組成和配置:
試劑一:液體×1 瓶,4℃保存。
試劑二:液體15mL×2 瓶, 4℃保存;
試劑三:粉劑×2 支, 4℃保存,臨用前取1 支試劑三,加0.6ml 無水乙醇充分溶解;
試劑四:粉劑×2 支,-20℃保存,臨用前取1 支試劑四,加少量試劑二溶解;
工作液配制:臨用前配制,向1 瓶試劑二中,加入溶解后的試劑三和試劑四各1 支,充分溶
解,過濾,4℃避光保存,可用1 周。
粗酶液提?。?/span>
細(xì)菌、細(xì)胞樣品制備
收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi),離心后棄上清;按照每200 萬細(xì)菌或細(xì)胞加入400μL 試劑一,
超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞(功率20%,超聲3s,間隔10s,重復(fù)30 次 );12000g 4℃離心30min,
取上清液待測。
2、組織:按照組織質(zhì)量(g):試劑一體積(mL)為1:5~10 的比例(建議稱取約0.1g 組織,
加入1mL 試劑一)進(jìn)行冰浴勻漿;12000g 4℃離心30min,取上清液待測。
3、液體:直接測定
測定操作:
1. 分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀預(yù)熱30min,調(diào)節(jié)波長到450 nm,蒸餾水調(diào)零。
2. 試劑二置于37℃水浴中預(yù)熱30 min。
3. 空白管:取微量玻璃比色皿/96 孔板,依次加入5μL 蒸餾水和200μL 試劑二,迅速混勻,
于450nm 處測定3min 內(nèi)吸光值變化,第10s 吸光值記為A1,第190s 吸光值記為A2。△A
空白管=A2-A1
4. 測定管:取微量玻璃比色皿/96 孔板,依次加入5μL 上清液和200μL 試劑二,迅速混勻,
于450nm 處測定3min 內(nèi)吸光值變化,第10s 吸光值記為A3,第190s 吸光值記為A4。△A
測定管=A4-A3
注意:空白管只需測定一次。
CarE 活性計(jì)算公式:
a. 使用微量石英比色皿測定的計(jì)算公式如下
1 組織中CarE 活性
(1) 按蛋白濃度計(jì)算
CarE 活性單位定義:每 mg 組織蛋白在 37℃反應(yīng)體系中每分鐘催化吸光值增加 1 定義為 1
個(gè)酶活單位。
CarE 酶活(U/mg prot)= (△A 測定管-△A 空白管) ×V 反總÷(Cpr×V 樣)÷T
= 13.67×(△A 測定管-△A 空白管)÷Cpr
(2) 按樣本鮮重計(jì)算
CarE 活性單位定義:每g 組織在37℃反應(yīng)體系中每分鐘催化吸光值增加1 定義為1 個(gè)酶活
單位。
CarE 酶活(U/g 鮮重)= (△A 測定管-△A 空白管) ×V 反總×(V 樣總÷V 樣)÷W÷T
=13.67×(△A 測定管-△ A 空白管)÷W
2 細(xì)菌或細(xì)胞中CarE 活性
CarE 活性單位定義:每1 萬個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞在37℃反應(yīng)體系中每分鐘催化吸光值增加1 定義
為一個(gè)CarE 活性單位。
CarE 酶活(U/104 cell)= (△A 測定管-△A 空白管) ×V 反總×(V 樣總÷V 樣)÷細(xì)胞密度(104
cell/mL)÷T=13.67×(△A 測定管-△A 空白管)÷細(xì)胞密度(104 cell/mL)
3. 液體中CarE 活性
CarE 活性單位定義:每毫升樣品在37℃反應(yīng)體系中每分鐘催化吸光值增加1 定義為1 個(gè)酶
活單位。
CarE 酶活(U/mL )= (△A 測定管-△A 空白管) ×V 反總÷V 樣÷T
=13.67×(△A 測定管-△A 空白管)
V 反總:反應(yīng)體系總體積,205μL=2.05×10-4L;V 樣總:上清液總體積,1 mL;V 樣:加入
上清液體積(mL),0.005 mL;Cpr:蛋白質(zhì)濃度,mg/mL;W:樣品質(zhì)量(g);T:反應(yīng)時(shí)間
(min),3min。
b. 使用96 孔板測定的計(jì)算公式如下