主要用途

植物腺苷酸激酶（Adenylate kinase）活性酶連續(xù)循環(huán)反應(yīng)光度法定量檢測(cè)試劑是一種旨在通過腺苷酸激酶、己糖激酶和葡萄糖6-磷酸脫氫酶的酶連續(xù)循環(huán)反應(yīng)系統(tǒng)下，伴隨的氧化型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）還原反應(yīng)后峰值的變化，即采用光度法來測(cè)定植物組織裂解樣品中酶活性的而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過精心研制、成功實(shí)驗(yàn)證明的。其適合于各種植物組織，包括種子（seed）、葉片（leaf）、根（root）、胚胎葉（cotyledon）、上胚軸（epicotyl）等腺苷酸激酶的總活性檢測(cè)。產(chǎn)品嚴(yán)格無菌，即到即用，操作簡捷，性能穩(wěn)定。 

保存方式

保存裂解液（Reagent B）、緩沖液（Reagent C）、反應(yīng)液（Reagent D）和底物液（Reagent E）在－20℃冰箱里；其余的保存在4℃冰箱里；底物液（Reagent E）避免光照；有效保證6月

用戶自備

1.5毫升離心管：用于樣品保存的容器

15毫升錐形離心管：用于樣品制備的容器

DOUNCE勻漿器：用于組織勻化

（微型）臺(tái)式離心機(jī)：用于樣品操作

比色皿或96孔板：用于光度分析的容器

分光光度儀或酶標(biāo)儀：用于光度分析

實(shí)驗(yàn)步驟

實(shí)驗(yàn)開始前，將－20℃冰箱里的試劑盒中的裂解液（Reagent B）置入冰槽里融化。然后進(jìn)行下列操作。

一、 樣品準(zhǔn)備

1． 準(zhǔn)備好新鮮的植物組織（葉片、谷粒、種子等），并秤重以確定500毫克組織重量 

2． （選擇步驟）放進(jìn)預(yù)冷的15毫升錐形離心管

3． （選擇步驟）加入xx毫升清理液（Reagent A）清洗1次

4． 即刻用刀片切碎組織

5． 放進(jìn)一個(gè)預(yù)冷的15毫升錐形離心管

6． 加入預(yù)冷的xx毫升裂解液（Reagent B）

7． 渦旋震蕩5秒，充分混勻

8． 即刻放進(jìn)預(yù)冷的DOUNCE勻漿器，在冰槽里用勻漿棒勻化組織（約80下）

9． 將所有組織勻漿物移入1.5毫升離心管，放進(jìn)4℃微型臺(tái)式離心機(jī)離心10分鐘，速度為300g 

10． 小心移出上清液（注意：不要觸碰沉淀物）到另一個(gè)新的預(yù)冷的15毫升錐形離心管

11． （選擇步驟）如果上清液含有肉眼可見的殘?jiān)?，重?fù)離心5分鐘一次，速度為300g 

12． 即刻移入到1.5毫升離心管

13． 移取10微升進(jìn)行蛋白定量檢測(cè)（注意：建議使用 Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒－GMS30030.1）

14． 放進(jìn)－70℃的冰箱里保存或置于冰槽里備用

二、 測(cè)定準(zhǔn)備

1． 開啟并設(shè)定好分光光度儀（溫度為37℃）：波長340nm，間隔60秒，讀數(shù)6次（共5分鐘），并置零 

2． 從－20℃冰箱里取出試劑，置于冰槽里融化；緩沖液（Reagent C）室溫下預(yù)熱均衡；底物液（Reagent E）避免光照

三、 背景對(duì)照測(cè)定

1． 移取xx微升緩沖液（Reagent C）到新的比色皿

2． 加入xx微升反應(yīng)液（Reagent D）

3． 加入xx微升底物液（Reagent E）

4． 上下傾倒數(shù)次，混勻

5． 在37℃溫度下孵育3分鐘

6． 加入xx微升陰性液（Reagent F）

7． 上下傾倒數(shù)次，混勻（限定在3秒之內(nèi)）

8． 即刻放進(jìn)分光光度儀檢測(cè)，此為背景空對(duì)照（5分鐘讀數(shù)－0分鐘讀數(shù)）

四、 樣品測(cè)定

1． 移取xx微升緩沖液（Reagent C）到新的比色皿

2． 加入xx微升反應(yīng)液（Reagent D）

3． 加入xx微升底物液（Reagent E）

4． 上下傾倒數(shù)次，混勻

5． 在37℃溫度下孵育3分鐘

6． 加入20微升待測(cè)樣品（50微克蛋白）（注意：樣品須清澈）

7． 上下傾倒數(shù)次，混勻（限定在3秒之內(nèi)）

8． 即刻放進(jìn)分光光度儀檢測(cè)，此為樣品讀數(shù)（5分鐘讀數(shù)－0分鐘讀數(shù)） 

五、計(jì)算樣品活性

六、 酶標(biāo)儀測(cè)定

1． 在96孔板上做好相應(yīng)標(biāo)記：背景對(duì)照和樣品

2． 分別移取xx微升緩沖液（Reagent C）到96孔板中的所有孔里

3． 分別加入xx微升反應(yīng)液（Reagent D）

4． 分別加入xx微升底物液（Reagent E）

5． 在37℃溫度下孵育3分鐘

6． 分別加入xx微升陰性液（Reagent F）或待測(cè)樣品（20微克蛋白）到相應(yīng)孔里（注意：樣品須清澈）

7． 輕輕搖動(dòng)96孔板

8． 即刻放進(jìn)酶標(biāo)儀檢測(cè)：0分鐘讀數(shù)和5分鐘讀數(shù)

9． 活性計(jì)算

注意事項(xiàng)

1． 本產(chǎn)品為20次（比色皿）和80次（96孔板）操作，包括背景對(duì)照

2． 操作時(shí)，須戴手套

3． 系統(tǒng)操作過程中，背景測(cè)定只需1次

4． 建議使用比色皿測(cè)定

5． 樣品須澄清，至關(guān)重要 

6． 加樣后3秒內(nèi)光度測(cè)定

7． 測(cè)定值由低到高變化；測(cè)定可持續(xù)5分鐘

8． 光度測(cè)定后，比色皿須清洗*

9． 樣本測(cè)定5分鐘讀數(shù)高于0分鐘讀數(shù)表明具有酶活性

10． 建議待測(cè)樣本蛋白濃度為50微克/20微升；如果樣本酶活性過低或過高， 則可以增加或降低樣本量（本公司提供  Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒－GMS30030.1）

11． 如果待測(cè)樣品濃度過高或過低，可以調(diào)整樣品濃度

12． 腺苷酸激酶單位活性定義為：在37℃，pH 7.6條件下，每分鐘內(nèi)能夠產(chǎn)生1微摩爾還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）所需的酶量作為一個(gè)活性單位

13． 本公司提供系列經(jīng)典細(xì)胞激酶檢測(cè)試劑產(chǎn)品