技術(shù)文章
Technical articles
更新時(shí)間：2022-10-20
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主要用途
逆轉(zhuǎn)錄酶（reverse transcriptase）活性PERT熒光(SYBR GREEN)定量PCR檢測試劑是一種旨在運(yùn)用SYBR綠色熒光染料作為標(biāo)記信號(hào)，結(jié)合產(chǎn)物增強(qiáng)型逆轉(zhuǎn)錄酶（PERT）的PCR擴(kuò)增，既方便、快速，又實(shí)時(shí)檢測和定量分析擴(kuò)增產(chǎn)物，即逆轉(zhuǎn)錄酶酶活性的而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過精心研制、成功實(shí)驗(yàn)證明的。廣泛應(yīng)用于臨床病毒感染、生物制品，例如疫苗等病毒污染的監(jiān)測。產(chǎn)品即到即用，性能穩(wěn)定，無核酶污染，操作便捷，敏感高效，定量準(zhǔn)確，重復(fù)性強(qiáng)。
保存方式
保存在－20℃冰箱里，避免反復(fù)凍融；染色液（Reagent F）避免光照，有效保證6月
用戶自備
1.5毫升離心管：用于樣品操作的容器
4℃微型臺(tái)式離心機(jī)：用于樣品操作
PCR管：用于樣品擴(kuò)增操作的容器
熒光定量PCR儀：用于熒光定量PCR反應(yīng)
實(shí)驗(yàn)提示
一、 標(biāo)準(zhǔn)樣品制備
1． 準(zhǔn)備好7個(gè)無菌的1.5毫升離心管，標(biāo)記為1至7號(hào)管
2． 按下表分別加入18微升的稀釋液（Reagent I）到2至7管
3． 移取5微升標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent H）到1號(hào)管
4． 小心移取2微升1號(hào)管的標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent H）到2號(hào)管，混勻
5． 小心移取2微升2號(hào)管稀釋的標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent H）到3號(hào)管，混勻
6． 小心移取2微升3號(hào)管稀釋的標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent H）到4號(hào)管，混勻
7． 以此類推
8． 將1至7號(hào)管放進(jìn)冰槽里備用；標(biāo)準(zhǔn)管濃度見下表
管號(hào) | 稀釋液（Reagent I） | 標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent H） | 標(biāo)準(zhǔn)逆AMV轉(zhuǎn)錄酶活性 |
1 | —— | 5微升 | 10－3單位/微升 |
2 | 18微升 | 2微升1號(hào)管 | 10－4單位/微升 |
3 | 18微升 | 2微升2號(hào)管 | 10－5單位/微升 |
4 | 18微升 | 2微升3號(hào)管 | 10－6單位/微升 |
5 | 18微升 | 2微升4號(hào)管 | 10－7單位/微升 |
6 | 18微升 | 2微升5號(hào)管 | 10－8單位/微升 |
7 | 18微升 | 空白對(duì)照 | 空對(duì)照 |
一、 定量檢測
1． 移取2微升引導(dǎo)液（Reagent A）到0.5毫升PCR管
2． 加入2微升底物液（Reagent B）
3． 加入6微升補(bǔ)充液（Reagent C）
4． 放進(jìn)4℃微型臺(tái)式離心機(jī)瞬時(shí)離心5秒
5． 在70℃溫度下孵育3分鐘
6． 冰上預(yù)冷
7． 加入13微升轉(zhuǎn)錄液（Reagent D）
8． 加入2微升上述制備的標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent H）或待測樣品（注意：選擇4個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品+空對(duì)照）
9． 總量25微升
10． 放進(jìn)4℃微型臺(tái)式離心機(jī)瞬時(shí)離心5秒
11． 在42℃溫度下孵育30分鐘
12． 在95℃溫度下孵育5分鐘
13． 置于冰槽里備用
14． 移取15微升反應(yīng)液（Reagent E）到0.5毫升PCR管
15． 加入2微升上述冰槽里備用的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物
16． 加入2.5微升染色液（Reagent F）
17． 加入5.5微升補(bǔ)充液（Reagent D）到總量25微升
18． 使用1000微升槍頭加入1滴封隔液（Reagent G）（注意：參見注意事項(xiàng)10）
19． 即刻放進(jìn)熒光定量PCR儀
20． 熒光定量PCR反應(yīng)程序?yàn)?/span>（選擇FAM染料）：
注意事項(xiàng)
1． 本產(chǎn)品為20次PCR反應(yīng)
2． 本產(chǎn)品檢測敏感度達(dá)10-8單位/微升
3． 操作時(shí)，須戴手套
4． 本產(chǎn)品適合各種熒光定量PCR儀
5． 建議整個(gè)操作在4℃下進(jìn)行
6． 必須使用帶濾芯的槍頭
7． 所有器皿、離心管、液體等無RNA酶污染
8． 使用時(shí)，避免污染母液
9． 用戶根據(jù)實(shí)際情況，選擇4至5管標(biāo)準(zhǔn)區(qū)間范圍
10． 根據(jù)用戶PCR儀的性能，決定是否加入封隔液（Reagent G）
11． 配制完成后，即刻進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，以確保反應(yīng)物的活性
12． 試劑避免反復(fù)凍融
13． PCR擴(kuò)增反應(yīng)的最初3個(gè)循環(huán)為定量基線；3至15個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào)的10倍值為熒光閾值；熒光信號(hào)達(dá)到閾值所需的循環(huán)數(shù)為Ct值；建議使用Log ΔRn相對(duì)定量參數(shù)（參考圖像如下）：
1． 通常103至104皮單位（pU）逆轉(zhuǎn)錄酶等于1至10個(gè)病毒粒子（virion）
2． 通常103皮單位（pU）逆轉(zhuǎn)錄酶等于70至80逆轉(zhuǎn)錄酶分子
3． 本公司提供系列逆轉(zhuǎn)錄酶活性檢測試劑產(chǎn)品
當(dāng)前位置：
