熒光免疫分析淺談

     1950年coons合成異硫氰酸鹽（熒光染料），用作標(biāo)記抗體做小鼠組織切片染色，開(kāi)創(chuàng)了免疫熒光技術(shù)（Immunofluorescence technique)，又稱為熒光抗體技術(shù)（Fluorescent antibody technique).由于漿抗原,抗體的反應(yīng)特異性與熒光的敏感性結(jié)合起來(lái)，因此，廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué),生物學(xué),分子生物學(xué),生物化學(xué),免疫學(xué)等領(lǐng)域，它分為創(chuàng)痛的免疫熒光技術(shù)和現(xiàn)代免疫熒光技術(shù)。

傳統(tǒng)的免疫熒光技術(shù)用異硫氰酸熒光黃（FITC),羅丹明標(biāo)記特異抗體，對(duì)組織切片,細(xì)胞細(xì)菌,病毒和液體物質(zhì)作固相熒光染色，熒光顯微鏡下分析熒光狀態(tài),分布。該技術(shù)及流式細(xì)胞儀和熒光偏振分析從至今仍廣泛用于臨床診斷和基礎(chǔ)研究。

現(xiàn)代熒光技術(shù)的應(yīng)用發(fā)展十分廣泛，如蛋白質(zhì),DNA，細(xì)胞膜受體，細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)，復(fù)合抗體，亞細(xì)胞分子的標(biāo)記等。儀器*。如熒光激活細(xì)胞分類儀(FACS)，單克隆熒光技術(shù)電子計(jì)算機(jī)圖像顯示儀，熒光自動(dòng)化分析測(cè)試儀。現(xiàn)代熒光免疫技術(shù)在標(biāo)記與探測(cè)上，稀土元素Eu配合物抗體標(biāo)記Eu（TIFA)的靈敏度。此外，還有競(jìng)爭(zhēng)性可磁性固相熒光，雙位點(diǎn)免疫熒光等。20世紀(jì)80年代在普通熒光標(biāo)記基礎(chǔ)上發(fā)展的新技術(shù)—時(shí)間分辨熒光技術(shù)（TRFIA)是以稀土離子標(biāo)記抗原或抗體，建立的細(xì)胞，核酸探針新技術(shù)。

將熒光法引入免疫分析主要是因?yàn)樗c分光光度法相比具有高的靈敏度，其靈敏度是分光光度法10—1000倍。人們尋找單分子檢測(cè)的工作幾乎都圍繞著熒光化合物，這本身就反映了熒光法在提高分析靈敏度方面的潛力。另外，熒光測(cè)定可以把熒光激發(fā)波長(zhǎng)，熒光發(fā)射波長(zhǎng)，熒光壽命，偏振等參數(shù)同時(shí)結(jié)合起來(lái)，形成特異而花樣繁多的分析系統(tǒng)。

熒光免疫分析的原理：

免疫熒光技術(shù)是以熒光素標(biāo)記抗體（或抗原),利用被檢物質(zhì)在反應(yīng)體系中特異結(jié)合位點(diǎn)熒光的強(qiáng)弱，有熒光顯微鏡,流式細(xì)胞分析儀和自動(dòng)化電子成像計(jì)算機(jī)進(jìn)行定性,定量分析的技術(shù)。通常用熒光素表及抗體,稱為熒光抗體技術(shù):其次是熒光素標(biāo)記抗原，稱為熒光抗原技術(shù)。熒光素是具有共軛雙鍵體系結(jié)構(gòu)的化合物，當(dāng)接受紫外光等照射時(shí)，由低能量級(jí)的基態(tài)向高能級(jí)躍遷，形成電子能量較高的激發(fā)態(tài)。當(dāng)墊子從激發(fā)態(tài)恢復(fù)支基態(tài)時(shí)，發(fā)出熒光

熒光標(biāo)記抗體

一 FITC標(biāo)記法（透析袋內(nèi)滲透標(biāo)記）

1將FITC溶于0.5mol/L，PH=9.2的碳酸鹽緩沖液中，使用FITC的zui終濃度為8-10mg/ml、2 將帶標(biāo)記的抗體裝入透析袋內(nèi)，4度條件下用0.15mol/L，氯化鈉溶液透析2D，期間換液3次。然后改用0.05mol/L，PH=8.5的碳酸鹽緩沖生理鹽水繼續(xù)透析4-5Hzui后，自用0.05mol/K.PH=9.2的碳酸鹽緩沖生理鹽水透析2h

3將該透析袋置于上述FITC溶液中透析，使用熒光素與抗體IgG結(jié)合。FITC的zui終濃度是0.1mg/ml。體積是透析袋IgG溶液體積的10倍。在4度條件下，透析14-16H

標(biāo)記抗體的純化

   純化的母的在于消除未結(jié)合的游離熒光素和結(jié)合熒光素過(guò)多的抗體。

將熒光素標(biāo)記的抗體裝入透析袋中，先用流水透析10秒。然后用0.01mol/LPH=7.1的磷酸鹽緩沖液或生理鹽水透析一周時(shí)間期間每天換液3次，直到外透析液在紫光燈下發(fā)射硬廣為止。