考馬斯亮藍(lán)G-250法測定蛋白質(zhì)含量

一、目的

學(xué)習(xí)和掌握考馬斯亮藍(lán)G-250測定蛋白質(zhì)含量的原理和方法。

二、原理

    考馬斯亮藍(lán)G-250（Coomassie brilliant blue G-250）法測定蛋白質(zhì)含量屬于染料結(jié)合法?？捡R斯亮藍(lán)G-250在游離狀態(tài)下呈紅色，zui大光吸收在465nm；當(dāng)它與蛋白質(zhì)結(jié)合后變?yōu)榍嗌?，該結(jié)合物在595nm波長下有zui大光吸收。在一定蛋白質(zhì)濃度范圍內(nèi)（0～1000ug/mL），其光吸收值與蛋白質(zhì)含量成正比，因此可用于蛋白質(zhì)的定量測定。蛋白質(zhì)于考馬斯亮藍(lán)G-250結(jié)合在2min左右的時(shí)間內(nèi)達(dá)到平衡，完成反應(yīng)十分迅速；其結(jié)合物在室溫下1h內(nèi)保持穩(wěn)定。該法是1976年由Bradford建立的，試劑配制簡單，操作簡便快捷，反應(yīng)非常靈敏，可測定微克級蛋白質(zhì)的含量，是一種常用的對微量蛋白質(zhì)進(jìn)行快速測定的方法。

三、實(shí)驗(yàn)用品

1. 實(shí)驗(yàn)材料：新鮮綠豆芽。
2. 器皿：

（1）、分析天平、臺式天平。

（2）、分光光度計(jì)。

（3）、離心機(jī)。

（4）、研缽1套。

（5）、離心管：10mL×1。

（6）、刻度試管：10mL×1或量筒：10mL×1。

（7）、移液管：5mL×1 , 2mL×1，1mL×2，0.1mL× 3.

（8）、試管：10mL× 14，試管架，洗耳球。

3、試劑

（1）、牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液：準(zhǔn)確稱取100mg牛血清白蛋白，溶于100mL蒸餾水中，即為1000ug/mL的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液。

(2)、考馬斯亮藍(lán)G-250：稱取100mg考馬斯亮藍(lán)G-250，溶于50mL95%的乙醇中，加入85%（m/V）的磷酸100mL，zui后用蒸餾水定容到1000mL。此溶液在常溫下可放置一個(gè)月。

四、操作步驟

1、標(biāo)準(zhǔn)曲線制作

（1）、0～100ug/mL標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作；取6支10mL的試管加入試劑，配制不同濃度的蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)液。

另取6支15mL的試管，從上述各試管中分別吸取0.1mL溶液，加入5mL考馬斯亮藍(lán)G-250，充分混勻，放置2min后用1cm光徑的比色杯在595nm波長下比色，記錄各試管測定的光密度值并作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

（2）、0～1000ug/mL標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

取6支10mL的試管，加入試劑。

其余步驟同操作步驟1，作出蛋白質(zhì)濃度為0～1000ug/mL的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2、樣品提取液中蛋白質(zhì)濃度的測定

（1）、待測樣品制備

稱取新鮮綠豆芽下胚軸2g放入研缽中，加2mL蒸餾水研磨成勻漿，轉(zhuǎn)移到離心管中，再用6mL蒸餾水分次洗滌研缽，洗滌液收集于同一離心管中，放置0.5～1b以充分提取，然后在4000r/min離心20min，棄去沉淀，上清液轉(zhuǎn)入10mL的刻度試管，并以蒸餾水定容至刻度，即得待測樣品提取液。

（2）、測定

另取2支10mL的試管，分別吸取樣品提取液0.1mL（至少重復(fù)一次），加入5mL考馬斯亮藍(lán)G-250試劑，充分混合，放置2min后用1cm光徑的比色杯在595nm下比色，記錄各管測定的光密度值，并通過過標(biāo)準(zhǔn)曲線查得待測樣品提取液中蛋白質(zhì)的含量X（ug）。以標(biāo)準(zhǔn)曲線1號試管做空白。

五、附注

1. 考馬斯亮藍(lán)G-250法由于染色方法簡單迅速，干擾物質(zhì)少，靈敏度高，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)含量的測定。
2. 有些陽離子和有機(jī)溶劑存在時(shí)不干擾測定，但大量的去污劑存在時(shí)會(huì)嚴(yán)重干擾測定。
3. 蛋白質(zhì)于考馬斯亮藍(lán)G-250結(jié)合的反應(yīng)十分迅速，反應(yīng)在2min左右達(dá)到平衡，其結(jié)合物在室溫下1h內(nèi)保持穩(wěn)定。因此測定時(shí)，不可放置太長時(shí)間，否則將使測定結(jié)果偏低。