影響酶促反應的因素—溫度、PH和抑制劑

目的要求

 通過本實驗了解pH、溫度、抑制劑對酶活力的影響。

實驗原理

 酶作為生物催化劑與一般催化劑一樣呈現溫度效應。酶促反應開始時，反應速度隨溫度升高增快。達到zui大反應速度時的溫度稱為某種酶的zui適溫度。由于絕大多數酶是有活性的蛋白質，當達到zui適溫度后，繼續(xù)升高溫度，引起蛋白質變性，酶促反應速度反而逐步下降，以致*停止。

    酶的zui適溫度不是一個常熟，與作用時間長短有關。測定酶活性均在酶促反應zui適溫度下進行。大多數動物來源的酶zui適溫度為37～40℃，植物來源的酶zui適溫度為50～60℃。

    酶的催化活性與環(huán)境pH有密切關系，通常各種酶只在一定pH范圍內才具有活性，酶活性zui高時的pH，稱為酶的zui適pH。高于或低于此pH時酶的活性逐漸降低。

   酶的zui適pH不是一個特征物理常數，對于同一個酶，其zui適pH因緩沖液和底物的性質不同而又差異。

   在酶促反應過程中，抑制劑對酶的抑制作用可分為可逆抑制和不可逆抑制?？赡嬉种朴懈鶕种苿┖偷孜锏年P系分為三種類型：競爭性抑制、非競爭性抑制和反競爭性抑制。

   在本試驗中，胰蛋白酶的zui適溫度為37℃，zui適pH值為8.1.胰蛋白酶的抑制劑為苯甲脒，其抑制方式為競爭性抑制。

試劑和器材

1、試劑

5%三氯醋酸溶液。1mmol/L苯甲脒溶液：稱取19.25g苯甲脒，用少量水溶解，定容至100mL。

1%酪蛋白溶液：取1g酪蛋白，加0.1mol/L氫氧化鈉溶液10mL、水40mL，置60℃水浴加熱至溶解，放置室溫后，加水稀釋成100mL，并調至pH8.0.

0.1mol/L硼酸緩沖液：

A液，0.1mol/L硼酸（H3BO3）：稱取6.18gH3BO3溶于1000mL水中。

B液，0.025mol/L硼砂（Na2B4O7·10H2O）：

稱取9.54g硼砂（Na2B4O7·10H2O）溶于1000mL水中。

pH7.4硼酸緩沖液：90mL A液+10mL B液

pH8.0硼酸緩沖液：70mL A液+30mL B液

pH9.0硼酸緩沖液：20mL A液+80mL B液

2、材料

胰蛋白酶溶液：50～200ug/mL，用0.1mol/L，pH8.0硼酸緩沖液配制。可用粗提的豬胰蛋白酶，用量根據實際測的比活值而定。

3、儀器

試管1.5cm×15cm（×19）；移液管1mL（×7），2mL（×3），5mL（×5）；量筒100mL（×1），恒溫水?。凰?0(0℃）；白瓷板；膠頭滴管。

操作方法

1、溫度對酶活力的影響

取3支試管，空白管：先在試管中加入1.0mL1%酪蛋白溶液和3.0mL5%三氯醋酸溶液，搖勻后，再加入0.2mL酶液，0.8mL蒸餾水，在37℃保溫10min。

將樣品管和空白管分別離心，3000r/min，5分鐘，取上清液于280nm處測定各管的吸光值，并比較之。

2、pH對酶活力的影響

取3支試管，空白管：先在試管中加入1.0mL1%酪蛋白溶液和3.0mL5%三氯醋酸溶液，搖勻后，再加入0.2mL酶液，0.8蒸餾水，在37℃保溫10min。

 將樣品管和空白管分別離心，3000r/min，5分鐘，取上清液于280nm處測定各管的吸光值，并比較之。

3、抑制劑對酶活力的影響

取3支試管，空白管：先在試管中加入1.0mL1%酪蛋白溶液和3.0mL5%三氯醋酸溶液，搖勻后，再加入0.2mL酶液，0.8蒸餾水，在37℃保溫10min。

將樣品管和空白管分別離心，3000r/min，5分鐘，取上清液于280nm處測定各管的吸光值。并比較之。

注意事項

1、由于胰蛋白酶活力不同，因此實驗應隨時檢查反應進行情況。如反應進行的太快，應適當稀釋酶液；反之，則應減少酶溶液的稀釋倍數。

2、注意不要在檢查反應程度時使各管溶液混雜。