氨基轉(zhuǎn)換作用

目的要求

1、了解轉(zhuǎn)氨酶在代謝過(guò)程中的重要作用。

2、學(xué)習(xí)應(yīng)用紙層析法鑒定氨基轉(zhuǎn)換反應(yīng)。

實(shí)驗(yàn)原理

    體內(nèi)a-氨基酸的a-氨基在氨基轉(zhuǎn)換酶的作用下，移換至a-酮酸的過(guò)程，稱氨基轉(zhuǎn)換作用。此類酶各有一定的特異性，普遍存在于動(dòng)物各組織中。

     本實(shí)驗(yàn)是將谷氨酸與丙酮酸在肌肉糜中谷氨酸-丙酮酸氨基轉(zhuǎn)換酶的作用下進(jìn)行氨基轉(zhuǎn)化反應(yīng)，然后用紙層析法檢查反應(yīng)體系中丙氨酸的生成。

   由于谷氨酸、丙酮酸在肌肉糜中可循其他代謝途徑分解和轉(zhuǎn)化，影響氨基轉(zhuǎn)換過(guò)程的觀察，因此在反應(yīng)體系中添加碘醋酸以抑制谷氨酸和丙酮酸的其它代謝過(guò)程。

試劑和器材

1、試劑

1%谷氨酸溶液；1%丙酮酸鈉溶液；0.1%KHCO3溶液；0.025%溴醋酸溶液；2%Hac溶液；0.1%標(biāo)準(zhǔn)谷氨酸溶液；0.1%標(biāo)準(zhǔn)丙氨酸溶液；1%KOH溶液。

展開劑；酚飽和水溶液（2份酚加1份水混合放入分液漏斗，振蕩。靜置24h后分層，取下層酚置瓶中備用）。

顯色劑：0.1%茚三酮正丁醇溶液。

2、材料

肌肉糜：取兔子肌肉2g，置研缽中，加0.9%氯化鈉溶液6mL，在低溫下研磨成細(xì)漿，離心5min，棄去沉淀，得肌肉糜提取液。

3、器材

試管1.5cm×15cm（×4）；研缽；毛細(xì)管；燒杯；恒溫水??；培養(yǎng)皿9cm（×2）；直徑13cm圓形濾紙；噴霧器；吹風(fēng)機(jī)。

操作方法

1、轉(zhuǎn)氨酶作用

（1）、取試管2支編號(hào)（1、2），向每個(gè)試管各加0.5mL谷氨酸溶液，0.5mL  1%丙酮酸鈉溶液，0.5mL 0.1%KHCO3和0.25mL 0.025%溴醋酸，混勻。然后分別加入肌肉糜提取液0.5mL，混勻，將其中一支試管立即在沸水浴中加熱2～3min做對(duì)照。用塞子塞住另一支試管，置于45℃水浴中保溫60min。

（2）、保溫完畢，取出試管。向每支試管中各加2%Hac溶液4滴，再置于沸水浴中2min，使蛋白質(zhì)*沉淀。過(guò)濾收集濾液代用。

2、層析驗(yàn)證

（1）、取培養(yǎng)皿一個(gè)，加入酚水飽和溶液，約0.5cm高。取圓形濾紙一張，在中心剪一直徑1～2mm的小孔，并以圓心約1cm為半徑劃一圓作為底線。在此底線上，用鉛筆點(diǎn)四個(gè)等距離的原點(diǎn)并表明1,2,3,4。

（2）、用毛細(xì)管分別吸取以上兩種濾液及標(biāo)準(zhǔn)谷氨酸、丙氨酸，依次點(diǎn)在標(biāo)明號(hào)碼的原點(diǎn)處，以吹風(fēng)機(jī)吹干，再重新點(diǎn)樣2～4次。注意斑點(diǎn)不能太大，一般直徑約0.3cm為宜。然后將濾紙平放在盛飽和酚的培養(yǎng)皿上。另取一條濾紙卷成筒狀，直徑1～2nm，將此小筒插入濾紙中心小孔，使層析濾紙通過(guò)此小筒與酚溶液相連。另取一大小相同的培養(yǎng)皿蓋在濾紙上，此時(shí)酚溶液即由濾紙中心孔向四周擴(kuò)散。

（3）、當(dāng)酚溶液擴(kuò)展到距離紙邊緣約1.5cm時(shí)，取出濾紙。用鉛筆化下酚溶液擴(kuò)展邊緣，用吹風(fēng)機(jī)吹干。用噴霧器噴以0.1%茚三酮溶液，再用熱風(fēng)吹干。用鉛筆圈下各顯色點(diǎn)。測(cè)定各顯色點(diǎn)的Rf值，并解釋之。

3、計(jì)算公式

Rf=原點(diǎn)至斑點(diǎn)中心的距離/原點(diǎn)至溶劑前沿的距離