熒光測量

   熒光信號是由對細(xì)胞進(jìn)行染色的特異性熒光染料受激后發(fā)射的。熒光波長與激發(fā)光波長不同且強(qiáng)度較弱，為此就要使用濾片以濾除非熒光信號并使用靈敏的探測器。下面我們將分別進(jìn)行討論。

光源

   常用的光源有弧光燈和激光。弧光燈的結(jié)構(gòu)簡單、價(jià)格便宜、維修容易，但在單一譜線上的功率較弱。激光單色性好、功率強(qiáng)大、不易散焦，但結(jié)構(gòu)復(fù)雜、價(jià)格昂貴、維修困難。至于選擇某種光源的某條譜線做為激發(fā)光源，主要是依據(jù)被激發(fā)的物質(zhì)，例如細(xì)胞的自身熒光物質(zhì)或熒光染料的激發(fā)光譜而定。光源的譜線愈接近被激發(fā)物質(zhì)的激發(fā)光譜的峰值，所產(chǎn)生的熒光信號愈強(qiáng)。

1、汞燈 弧光燈中zui常用的是汞燈，汞燈中又以100W汞燈zui常用。汞燈的發(fā)射譜線有一個(gè)微弱的背景，其譜線大部分在300—450nm，550nm附近也有，由于在300nm波長的紫外范圍有一系列譜線，所以要求用紫外激發(fā)的場合使用汞燈很是方便。汞燈啟動(dòng)容易，啟動(dòng)后數(shù)分鐘就可以達(dá)到全功率輸出，但當(dāng)熄滅后需待*冷卻才可重新啟動(dòng)。某些較新型號的汞燈里面有第三個(gè)啟動(dòng)電極，可以熱啟動(dòng)。

汞燈點(diǎn)火后內(nèi)部壓力可達(dá)40大氣壓，所以外部必須有可靠的屏蔽，未冷卻下來的汞燈不可折卸，調(diào)換汞燈時(shí)要十分當(dāng)心。汞燈的缺點(diǎn)之一是44nm—540nm間無可以利用的譜線，這妨礙了某些熒光染料的使用。

2、激光  激光與普通光線不同；激光是受激輻射，普通光線是自發(fā)輻射。激光基本是沿著直線傳播，發(fā)散角很小，通常在10-6球面度量級的立體角內(nèi)，必要時(shí)很容易聚焦到與細(xì)胞同一數(shù)量級。激光的亮度高，即在單位面積、單位立體角內(nèi)輸出功率特別大。激光還具有良好的單色性，這些特點(diǎn)都是汞燈所不具備的。

    流式細(xì)胞術(shù)中使用的多為氬離子激光器，亦有用氪離子激光器或染料激光器以獲得不同的譜線者。氬離子激光器是一種氣體激光器，其頻率穩(wěn)定性高、相干性好，壽命長。它是通過氣體放電使氬離子電離并激發(fā)，實(shí)現(xiàn)粒子數(shù)反轉(zhuǎn)而產(chǎn)生激光，譜線有十余條，其中綠光514nm和藍(lán)光488兩條譜線增強(qiáng)，幾乎占總輸出功率的80%。由于這種激光在氣體放電過程中要氏氬原子一次電離必須供給相當(dāng)大的能量，所以要求有幾百伏和每平方毫米幾個(gè)安培的穩(wěn)定電源。

     激光器的結(jié)構(gòu)，放電管由內(nèi)徑3mm氧化鈹毛細(xì)管做成，內(nèi)充0.7mm汞柱的氬氣同時(shí)架上0.1特斯拉的軸向磁場。此磁場的作用是對帶電粒子起約束作用，結(jié)果提高了放電區(qū)中心的電子密度和離子密度，從而提高了輸出功率。色散棱鏡用來選擇激光波長，使得除某一特定波長之外其他波長的損耗都非常大，只要調(diào)整反射鏡的角度就你能調(diào)諾到所需求的波長。如果用平面鏡代替色散棱鏡，激光器的輸出功率夠到散熱速度的限制，又由于腔內(nèi)放電功率很大，約為5000w/cm3，相應(yīng)的溫度為3000—5000度K，所以放電管要通循環(huán)以加強(qiáng)冷卻，并用導(dǎo)熱率高的氧化鈹毛吸管以提高，輸出功率，現(xiàn)代有些150mW或功率更低的，可用強(qiáng)制風(fēng)冷，壽命可達(dá)5000小時(shí)。

    氪離子激光器與氬離子激光器類似，但譜線集中在可見光長波部分，以647nm較強(qiáng)，但噪聲較大。染料激光器是將有機(jī)染料溶液為另一激光器泵浦發(fā)出長波長的激光，例如用氬離子激光器514nm激光泵譜含有Rhodamine  6G水溶液的染料激光器，則后者可輸出從550nm到650nm連續(xù)可變的激光，在590nm處轉(zhuǎn)換效率可高達(dá)50%。免疫學(xué)上使用的一些染料，其激光光波長在550nm以上，這時(shí)就可用染料激光器。