NADPH-  胞色素 C 還原酶 NCR  試劑盒說(shuō)明書(shū)

測(cè)定意義

胞色素 P450 酶是一組 要存在于肝臟的同工酶，在外源物質(zhì)代謝中 有重要作用，尤是藥物和毒物的代謝 NCR 作 P450 酶系的重要一員，催化氧化型 P450 還原再生

測(cè)定原理

NCR 催化 NADPH 還原氧化型 胞色素 c，還原型 胞色素 c 在 550nm 處有特征吸收峰通過(guò)測(cè)定 550nm 吸光度的增加速率，來(lái) 算 NCR 活性

自備儀器和用品

可見(jiàn)分光光度計(jì)、普通離心機(jī)，超速離心機(jī)、可調(diào)式移液槍、1mL玻璃比色皿和蒸餾水。

試劑組成和配制

試劑一：粉劑×1 瓶，4℃保存。臨用前加 100mL 蒸餾水充分溶解。

試劑二：液體×1 瓶，4℃保存。

試劑三：粉劑×1 瓶，-20℃保存。臨用前配制，加 2.6 mL 蒸餾水充分溶解，4℃保存。

試劑四：粉劑×1 瓶，4℃保存 臨用前配制，加 550 µL 蒸餾水充分溶解，4℃保存。

粗酶液提取

1、除去細(xì)胞核和線粒體等：稱(chēng)約0.5g組織，加入4℃預(yù)冷的1mL試劑一，冰上充分研磨，10 000g4℃離心30min，取上清液，轉(zhuǎn)移到超速離心管中。

2、粗制微粒體：4℃，100 000g，離心60min，棄上清液。

3、除血紅蛋白等雜質(zhì)：向步驟2的沉淀中加1mL試劑一，蓋緊后充分振蕩溶解，100 000g離心30min，棄上清液。

4、zui終微粒體：向步驟3的沉淀中加試劑二0.5mL，蓋緊后充分振蕩溶解，4℃保存待測(cè)。

NADPH-細(xì)胞色素C還原酶測(cè)定操作：

1、分光光度計(jì)預(yù)熱30min以上。調(diào)節(jié)波長(zhǎng)到550nm，蒸餾水調(diào)零。

2、試劑二在37℃水浴中預(yù)熱30min以上。

3. 空白管 取 1mL 玻璃比色皿，依次加入 50µL 蒸餾水 900µL 試劑二 50µL 試劑 和 10µL 試劑四，迅速混勻后于 550nm 處測(cè)定 2min 內(nèi)吸光值變化，第 10 s 和第 130 s 吸光值 注意空白管只需做一次 。

4. 測(cè)定管 取 1mL 玻璃比色皿，依次加入 50µL 粗酶液 900µL 試劑二 50µL 試劑 和 10µL，試劑四，迅速混勻后于 550nm 處測(cè)定 2min 內(nèi)吸光值變化，第 10 s 和第 130 s 吸光值。

NCR 活性 算

(1).按照蛋白濃度 算:

活性單位 U  定義 37℃中， 毫克蛋白 分鐘催化產(chǎn)生 1µmol 還原型 胞色素 C

NCR (U/mg prot)= (△A 測(cè)定管-△A 空白管)÷ε÷d×V 反總÷  Cpr×V ÷T

= 0.529×(△A 測(cè)定管-△A 空白管)÷Cpr

(2)按照 本質(zhì) 算:

活性單位 U  定義 37℃中， 克 品 分鐘催化產(chǎn)生 1µmol 還原型 胞色素 C

NCR (U/g)= (△A 測(cè)定管-△A 空白管)÷ε÷d×V 反總÷  W×V ÷V 總 ÷ T

= 0.265×(△A 測(cè)定管-△A 空白管)÷W

ε ：還原型 胞色素 C 摩爾消光系數(shù)，19100L/mol/cm=0.0191L/µmol/cm；d：比色皿光 ，

1cm：V反總：反應(yīng)體系總體，1010uL=0.00101L：Cpr：上清液蛋白質(zhì)濃度，mg/mL，需要另外測(cè)定：V樣：加入反應(yīng)體系中清液體，50uL=0.05mL： V 樣總：加入提取液體，0.5mL：W ：本質(zhì)，g ：T：反應(yīng)時(shí)間，2min。